以下文章来源于爱光学 ，作者有理想

多光子显微镜可以解析组织深处的结构及功能信息，对于生物医学研究具有重要意义，但应用于活体成像时常因传统物镜的机械尺寸和光学距离而受限。目前市售的多光子显微物镜，大多为水浸物镜且仅有小于10 mm的较短工作距离。多光子成像物镜尖端因较短的工作距离，难免与镜下其他仪器相撞；另一方面，活体脑成像依赖的较大开颅创面可能会加剧免疫反应，降低组织清晰度，不利于长时程观测。此外，浸水物镜下引入的水、凝胶等介质可能导致折射率失配、产生气泡，降低图像质量。在常规物镜结构约束下，增大物镜工作距离则可能导致成像视场减小、数值孔径减小，因此通过光学结构设计和实现达到各参数的权衡具有一定的挑战性。

针对上述问题，来自加州大学圣塔芭芭拉分校的Spencer L. Smith团队在Nature Methods上发表了题为“The Cousa objective: a long-working distance air objective for multiphoton imaging in vivo”的文章。该工作报道了一种超长工作距离（20 mm）的空气物镜，称为Cousa物镜。它针对多光子成像波长的性能进行了优化，提供超过4 mm2的视场和亚微米级横向分辨率，并与常用的多光子成像系统兼容，且光学镜组面型、厚度、材料等参数均开源共享。此外，该文章还报道了Cousa物镜在多种生物样品（包括非人灵长类动物）的活体双光子、三光子成像性能结果。

原文链接：The Cousa objective: a long-working distance air objective for multiphoton imaging in vivo | Nature Methods

研究内容与方法

Cousa物镜主要围绕三个因素进行设计：（1）便于在动物成像实验中使用的几何参数；（2）优化具有亚细胞分辨能力的大视场双光子成像；（3）与商业双光子成像系统的兼容性。

为了兼容商用显微镜系统，通过对物镜尺寸进行限制进行光学模型仿真。该光学模型预测在±0-3°的扫描角度下，910 nm、920 nm和930 nm光的波前误差较低，斯特列尔比很高，远远超出了衍射极限。对于800~1300 nm的更宽波长范围，在±0-3°扫描角度范围中，波前误差RMS值保持在衍射极限以下，此时允许焦平面随波长自然移动，此时校正环提供了额外的优化空间（图1a）。

图1  光学设计和基准测试

为了测量定制的长工作距离空气物镜（图1b）成像性能，该工作验证在不同扫描角度内的成像分辨率一致性，对嵌入荧光小球的样品进行双光子激发的点扩展函数测量，结果表明从轴上至轴外±3°扫描角内的横/纵向分辨率与衍射极限分辨率没有区别（图1c左）。对周期性的荧光小球阵列成像结果表明该大视场物镜可以在±3°扫描角下实现2mm×2 mm的标称视场，而在±5°扫描角下扩展视场可达3 mm×3 mm（图1c右）。

图2  Cousa物镜与传统物镜的区别与定量比较

传统显微物镜由于各大厂商的机械外壳限制，成像参数被限制在了视场FOV与工作距离WD的乘积范围内，如图2a、b虚线所示。Cousa物镜的独特之处在于它突破了传统物镜的机械外壳尺寸限制，同时实现了长工作距离（WD = 20 mm）与大数值孔径（NA = 0.5）的优点。与市售物镜参数相比，Cousa物镜在特定波长具有更高的透过率（图2c）和更大的FOV（图2d）。同一只活体清醒小鼠自发神经活动的钙成像原始结果表明，Cousa物镜与最常用的水浸物镜（Nikon×16/0.8 NA）的信噪比及信号通量变化具有相近水平。

图3 小鼠的双光子和三光子成像结果

该工作进一步探究了用Cousa长工作距离物镜进行经棱镜的时间平均双光子成像及介观宽场成像结果（图3a），结果与市售物镜差异较小。同时基于Cousa物镜进行了活体功能成像研究，在长工作距离下对仰卧位的小鼠耳蜗毛细胞进行非接触式成像，相较于传统尼康物镜（Nikon ×20/0.4 NA，19 mm WD，TU PlanELW20X）可以在较低光功率下实现荧光信号的保持，首次实现了耳蜗毛细胞的活体双光子钙成像。此外，该工作也验证了Cousa物镜支持大视场三光子成像的能力（图3c），所提供的三光子和THG成像与传统物镜相比毫不逊色，而且Cousa的视场面积（2,000 μm×2,000 μm）比传统物镜（750 μm×750 μm）大7倍。

图4 大型哺乳动物的双光子成像

在对清醒猴子进行双光子脑成像时，Cousa物镜直接用空气代替浸水，实现单个神经元的神经元活动的解析，比传统物镜的成像时间更长，在小口径、大开角的颅窗条件下，可以增强在体多光子成像的稳定性（图4a）。对于头骨较厚且突出的雪貂、树鼬等动物进行活体双光子成像时，Cousa物镜也展示出传统物镜不可及的成像深度和大FOV，实现感兴趣的单个神经元信号探测（图4b、c、d）。该工作进一步对猪眼神经环路进行研究，首次透过完整猪眼实现猪眼底视网膜双光子成像（图4e），可完整分辨单个细胞（箭头所示）和轴突细胞（三角形所示）。

总结与展望

该工作开发了一种接口通用、结构新颖的显微镜物镜（Cousa），将长达20 mm的工作距离与高达0.5的数值孔径相结合，优化了多光子成像和长有效焦距，从而提供了4 mm2的FOV（在±5°扫描时高达9 mm2）。制造的物镜已分发给一系列实验室，其结果展示了体内功能和结构的双光子、三光子和THG成像，首次实现耳蜗毛细胞中的体内双光子钙成像，首次通过完整眼睛对猪视网膜进行双光子成像，展示了用于体内三光子和THG成像的最大FOV之一，以超长工作距离解析细尺度结构，例如顶端树突和轴突束。该镜头结构描述已完全开源，便于读者复现和优化，以进一步满足清晰、快速、深层、活体的生物医学光学成像需求及各类镜下实验需求。